CRISPR-Cas-geenieditorin keksintöä kutsutaan biologian vallankumousksi. Tutkijat lupaavat käyttää sitä maatalouden kasvi- ja eläinrotujen parantamiseen, ihmisten synnynnäisten geneettisten sairauksien hoitamiseen. RIA Novostin kirjeenvaihtaja kävi katsomassa ketä ja miten genomia muokataan.
Moskovan valtionyliopiston genominkäsittelykeskus avattiin hieman yli vuosi sitten - kampuksella. Minun tapaa sen johtaja, kemian tohtori Peter Sergiev, ja kun ajamme hissillä, hän omistaa vähän geenitekniikan historiaan.
”Genomia on muokattu aiemmin. Mutta siihen oli vaikea luoda työkaluja, kesti kauan, ja tulos ei usein ollut sellainen, kuin halusimme”, hän sanoo.
Vivariumissa Pjotr Vladimirovitš muuttuu sinisiksi laboratoriovaatteiksi, he antavat minulle kertakäyttöisen valkoisen haalarit ja pyytävät minua pyyhkimään kameran alkoholilla. Nyt Petr Vladimirovitš näyttää kirurgilta ja minä - kuin laboratorion assistentti sarjasta "CSI - rikos kohtaus".
Steriilissä laboratoriossa on meille valmistettu astia, jossa on hedelmöitettyjä hiiren munia, ja koeputki RNA-liuoksella. Se on kaikki mitä tarvitset CRISPR-Cas -genomin muokkaamiseen.
CRISPR on englanninkielinen lyhenne ilmaukselle, joka tarkoittaa kirjaimellisesti "säännöllisesti ryhmiteltyjä lyhyitä palindromisia toistoja". Itse asiassa nämä ovat vain pieniä osia bakteriofaagivirusten DNA: sta, joka on upotettu bakteerin genomiin. Näitä sekvenssejä tarvitaan bakteerien immuunijärjestelmän toimimiseen ja toimimiseen eräänlaisena "poliisin haluamana" ilmoituksena. Jos bakteeri selviää bakteerifaagilla saastuttamisensa jälkeen, se käyttää Cas-proteiini-entsyymejä leikkaamaan osan DNA: staan ja lisäämään sen genomiinsa myöhemmin tunnistettavaksi. Bakteerien genomi perii tämän "vihollisten" kirjaston, jonka aiemmat sukupolvet ovat huolellisesti keränneet.
Vuonna 2013 tutkijat selvittivät, että Cas-proteiini toimii missä tahansa organismissa, myös nisäkkäissä. Hän pystyy tekemään suunnanmuutoksia DNA-molekyylin molemmissa juosteissa ja siten muuttamaan perimää.
Mainosvideo:
Munan käsittely
Petr Sergiev tekee mikrotuotteessa sadan mikronin halkaisijan omaavan lasikapillaarin, vetää munan siihen ja siirtää sen lasin alle ravintoalustalla. Valmis näyte lähetetään optisen mikroskoopin vaiheeseen. Monitori näyttää suurennetun kuvan munasta, tärisevän kapillaarin kärjessä. Kaksi pyöristettyä pistettä erottuu - nämä ovat ytimiä äidin ja isän DNA: lla.
Tutkija valmistaa toisen kapillaarin, jonka suuruusluokka on halkaisijaltaan pienempi. Tämä on injektioruisku. Se kerää liuoksen, jossa on kahden tyyppistä RNA: ta, ja lävistää muna kevyesti manipulaattorien avulla. Siinä kaikki, injektio on tehty.
Munaan injektoitu RNA tarvitaan genomin leikkaamiseksi määrätyssä paikassa. Yksi RNA-tyyppi sisältää tiukasti määritellyn nukleotidisekvenssin, samanlainen kuin mitä aiomme muuttaa. Tämän RNA: n tehtävänä on löytää vastaava alue DNA: sta, siksi sitä kutsutaan "ohjaimeksi". Toisen tyyppinen matriisi RNA on eräänlainen ohje Cas9-nukleaasiproteiinin synteesille. Tämä proteiini toimii katalysaattorina kemialliselle reaktiolle, joka hajottaa fosfodiesterisidokset hyvin määriteltyjen DNA-emästen välillä. Koska proteiinimolekyylillä on kaksi nukleaasikeskusta, molemmat DNA-juosteet avataan, lisäksi paikassa, jonka koordinaatit Cas9 "lasketaan" ohjaus-RNA: n kanssa.
DNA-molekyyli pitää molempien juosteiden katkeamista vakavana hajoamisena ja pyrkii korjaamaan sen. Solussa kelluvat eksonukleaasientsyymit poistavat välittömästi useita nukleotidejä tauon molemmista päistä. Tämä riittää rikkomaan tai, kuten geneetikot sanovat, “sammuttamaan” geenin.
Kuinka CRISPR-Cas9-genomieditori toimii / Kuva RIA Novosti. Alina Polyanina.
Jos tarvitaan esimerkiksi suunnattua mutaatiota, on tarpeen merkitä proteiini proteiinin jäljittämiseksi kehossa, sitten toinen templaatti lisätään kompleksiin kahteen RNA: hon erityisen suunnitellun DNA: n muodossa. Se koostuu sekvensseistä, jotka ovat identtiset tulevan tauon reunojen kanssa, ja sisältää myös lisättävän osan. Sen jälkeen kun Cas9 on leikannut DNA-molekyylin, sen päät yhdistetään käyttämällä tätä ylimääräistä templaattia, joten tarvitsemme nukleotidisarja lisätään taukoon.
”Voimme kiinnittää pienen pyrstön oravaan, jonka avulla on kätevä vetää se ulos ja nähdä, minkä kanssa se toimii. Voimme lisätä geenin, mutta se ei ole yhtä tehokas kuin sammuttaa sen , tutkija selittää edelleen.
GMO: t ja kimeerit
Muokattu muna siirretään korvikehiiren kohdun putkeen. Hän asui jonkin aikaa miehen kanssa, jonka siemenputket olivat sidoksissa. Pari oli normaalia sukupuolielämää, mutta ei pystynyt raskaaksi. Siitä huolimatta hiiren vartalo uskoi olevansa raskaana ja muodosti hänelle sopivan hormonaalisen taustan. Nyt tällä naaraalla on jonkun toisen sikiö.
Kolmessa viikossa hän synnyttää tavallisimmat hiiret. Tutkijat odottavat, kunnes jyrsijät kasvavat, ottavat heiltä pienen osan häntäänsä ja analysoivat muokatun DNA-osan PCR-menetelmällä. Mutaatio tai vammainen geeni löytyy yli puolet tapauksista. Käänteinen menetelmä - sekvenssin insertointi genomiin - onnistuu vain 10%: n kokeissa.
Erilaisia mielenkiintoisia tehosteita esiintyy muokattaessa. Esimerkiksi syntyy mosaiikkihiiriä tai kimimerejä, joissa on soluja, joilla on erilaiset äidin ja isän genomit. Cas9 voi leikata DNA: ta monta kertaa, mutta sitä koodaava lähetti-RNA ei ole ikuinen, ja injektoitu liuos katoaa yksinkertaisesti sarjasta solujakautumista. Joskus toimittaja ampuu edelleen, kun pronukytit ovat sulautuneet ja muna on jaettu. Ja koska DNA: n korjaus repeämisen jälkeen on aina satunnainen prosessi ja paraneminen ei ole koskaan samaa, silloin jotkut yhden organismin soluista sisältävät toisen mutaation.
Tieteelle ja lääketiedelle
Muutamme viereiseen huoneeseen tarkkailemaan perimän muokkaamista koskevien kokeiden tuloksia. Vasemmalla hyllyillä - säiliöt geneettisesti muunneltuilla hiirillä, oikealla - tavallisilla jyrsijöillä valvontaa varten. Niitä kasvatettiin, kuten vasemmalla, mutta genomia ei manipuloitu. Tarvitaan kontrollihiiriä, jotta normaalilla olisi silmämme edessä ja verrata kokeessa saatuja olentoja sen kanssa.
Pjotr Sergiev ottaa yhden astiasta parin harmaata hiiriä. Ulkoisesti ne ovat täysin tavallisia, mutta heillä ei ole jälkeläisiä. Tosiasia, että miehillä yhden RNA-metyylitransferaasien geeni, vain entsyymissä tuotettu entsyymi, kytketään pois päältä. Ei-aktiivisella geenillä urokset syntyvät steriileinä. Geenin ja entsyymin tarkka tarkoitus on edelleen tuntematon. Tämän selvittämiseksi laboratoriossa kasvatettiin kahta hiiren kantaa: toisella oli geeni pois päältä, toisessa proteiini, joka oli merkitty genomieditorilla.
”Tämän geenin mutaatio löytyy myös ihmisistä - silloin mies kärsii hedelmättömyydestä. Mutta ennen kuin selvitämme miksi sitä tarvitaan, miksi se muuttaa RNA: ta, emme voi auttaa tällaisia potilaita”, tiedemies perustelee.
Itse asiassa emme vieläkään tiedä useimpien ihmisen geenien toimintaa. Tämän selvittäminen on perustavanlaatuinen tehtävä, jonka ovat ratkaisseet monet tutkimusryhmät ympäri maailmaa, myös Venäjällä. Hiiren genomi on hyvin samanlainen kuin ihmisillä. Toivotaan, että CRISPR-Casin avulla minkä tahansa olennon genomitutkimus etenee nopeammin.
Sergiev-ryhmä yhdessä N. N. NN Petrova ryhtyi etsimään mutaatioita, jotka johtavat tiettyihin syöpätyyppeihin. Lähimpiin suunnitelmiin sisältyy hanke geneettisesti muunnettujen eläinten luomiseksi maataloudelle yhteistyössä Venäjän tiedeakatemian ja Venäjän tiedeakatemian geenibiologian tutkimuslaitoksen kanssa.
”CRISPR-Cas on loistava työkalu, jonka avulla voit muuttaa genomia oman harkintasi mukaan, olla vähän jumala. Viime kädessä tieteen tehtävänä on ymmärtää, kuinka sellainen monimutkainen olento kuin nisäkäs toimii, kertoo tutkija.
Tieteen perustavanlaatuisten ongelmien ratkaiseminen on hienoa, mutta mitä tämä tekniikka antaa lääketiedelle? Lähitulevaisuudessa valitettavasti ei paljon. Munan muokkaaminen ja geneettisesti muunnetun hiiren nostaminen on helppoa, mutta aikuisen eläimen geenejä ei voida korjata, puhumattakaan ihmisestä.
Menetelmät DNA: n muokkaamiseksi somaattisissa (ts. Jo muodostuneissa soluissa) ovat edelleen erittäin tehottomia. Jotta voit viedä soluun jonkin mutaation avulla pois kytketyn geenin ja pakottaa sen tuottamaan tiettyä proteiinia, sinun on poistettava osa soluista kehosta, muokata niissä olevaa DNA: ta ja laittaa se takaisin vartaloon. Periaatteessa on toivoa, että tällä tavoin on mahdollista torjua sairauksia, kuten Duchennen lihasdystrofiaa tai kystistä fibroosia, kun on tarpeen palauttaa joidenkin solujen työkyky. Syövän alttiuden suhteen genomiikkatoimittaja on toistaiseksi voimaton. Jos mutanttigeeni löytyy henkilöstä, niin se löytyy kehon kaikista soluista. On epärealistista muuttaa kaikkia niitä. Ja jokainen solu, jolla on mutaatio, aiheuttaa vaaraa.
Mutta vaikka CRISPR / Cas auttaa vastaamaan vain joihinkin peruskysymyksiin ja sallii harvinaisten geneettisten sairauksien hoidon, se on silti suuri askel eteenpäin ihmiskunnalle.
Tatjana Pichugina