Näytteet muumioiden kudoksista nimillä "Maria" ja "Vavita" lähetettiin Perusta Venäjän laboratorioon tutkimusta varten. Toimitettuja biologisten kudosten näytteitä tutkittiin käyttämällä pyyhkäisyelektronimikroskopiaa, Raman-spektriä, ICPE, ja piimaan (koostumus muumioiden ihon pinnalla) koostumusta tutkittiin. Suoritettiin myös tutkimus siirrettyjen kudosten DNA: sta.
näytteen valmistus
Kudosnäytteet, molemmat 500 μg, siirrettiin muoviputkiin ja liuotettiin 1 ml: aan puskuria (10 mM Tris-HCl, pH = 10,5, 1 mM EDTA, 0,15 M NaCl). Tuloksena oleviin suspensioihin lisättiin Na-dodekyylisulfaattia 0,5%: iin, kuumennettiin +80 ° C: seen ja 10 minuutin kuluttua proteinaasi K (enintään 500 μg / ml) laitettiin termostaattiin (+55 ° C) 24 tunniksi.
Proteiinienpoisto poistettiin fenolimenetelmällä: lisäämällä suspensioon yhtä suuressa määrin fenolia, sitten fenoli: kloroformi (1: 1), kloroformi; kunkin lisäyksen jälkeen sekoitettiin jatkuvasti kulmaroottorilla ja sentrifugoitiin nopeudella 15 tuhatta rpm, 10 min.
Kolmannen sentrifugoinnin jälkeen saatuun super-sedimenttiin lisättiin 1/10 osa tilavuudesta 1 M NaCl: a ja 2,5 tilavuutta kahdesti tislattua etyylialkoholia, ja jätettiin yön yli -30 ° C: seen kartiomaisiin koeputkiin - "Eppendorf". Sentrifugointi suoritettiin 15 tuhannella tilavuudella. min. 10 minuutin kuluessa ja vastaanotettu DNA "saostui" ruskean sakan muodossa. DNA-pelletti pestiin kahdesti 70-prosenttisella etyylialkoholilla ja kuivattiin huoneenlämpötilassa (1 tunti) ja liuotettiin sitten TE-puskuriin.
PCR suoritettiin ohjelmoitavalle lämpösyklerille "My Cycler" ("Bio = Rad") käyttämällä vakiooligoprimeerejä, jotka syntetisoitiin kiinteän faasin menetelmällä yhdistyksessä "Beagler" (Pietari). Amplifikaatioon tarkoitettu reaktioseos tilavuudella 25 μl sisälsi: 15 nM kutakin oligoprimeria, 67 mM Tris-HCI, pH = 8,8 +25 ° C: ssa, 16,6 mM (NH4) S04, 6,7 mM MgCl2, 6,7 μM EDTA, 10 mM 2 merkaptoetanolia, 170 μg / ml BSA: ta ja seosta, jossa on neljä emäksistä dNTP: tä, pitoisuutena 1,0 mM, ja lämpöstabiili DNA-polymeraasi Thermus thermophilis (5 U / μl) (NPO SibEnzim). Denaturoinnin (10 min, 94 ° C) jälkeen suoritettiin 35 amplifikaatiosykliä kullekin testijärjestelmälle: 94 ° C - 1 min, 58 ° C - 1 min, 72 ° C - 1 min. Spesifisyyden kontrolloimiseksi reaktioon vietiin DNA-näytteitä, joilla oli tutkittujen lokusten tunnetuilla genotyypeillä (merkkijärjestelmät), sekä kontrollinäytteitä.joka sisältää reagenssiseoksen ilman DNA: ta. Monistamisen jälkeen värjäyspuskuri lisättiin reaktioseoksen alikvootteihin (7 μl) ja erotettiin pystysuoralla elektroforeesilla 6-prosenttisessa polyakryyliamidigeelissä (210x150x1 mm), värjättiin etidiumbromidilla ja valokuvattiin ultraviolettivalossa. Alleelien tunnistamiseksi käytettiin näitä lokuksia vastaavia alleelistandardeja ("tikkaat").
Mainosvideo:
DNA-analyysi
Tutkimuksessa käytettiin ihmisen DNA: n eksomeanalyysimenetelmää, joka perustui korkean suorituskyvyn sekvensointiin rikastuksella hybridisaatiolla.
Ihmisen DNA: n eksome-analyysimenetelmä.
2 näytettä analysoitiin … Kaikki näytteenvalmistuksen vaiheet ennen PCR: ää suoritettiin puhtaissa huoneissa. Näytteen valmistus, DNA: n uutto ja yksittäisten DNA-fragmenttien monistaminen suoritettiin eri huoneissa.
Spesifiset sovittimet (KAPA Library Preparation Kit ja SeqCap Adapter Kit; Roche) ligoitiin genomisen fragmentoituneen DNA: n päihin (~ 5 ng), minkä jälkeen suoritettiin kaksivaiheinen fragmenttien valinta pituusalueella 200-350 bp käyttämällä AMPureXP Beads (Beckman Coulter). … Saatuja fragmentteja monistettiin adapterispesifisillä alukkeilla ja hybridisoitiin biotinyloiduilla spesifisillä koettimilla (NimbleGen SeqCap EZ Choice MedExome; Roche) 28 tunnin ajan 47 ° C: ssa. Yhdessä reaktiossa yhdistettiin kaksi DNA-näytettä. Biotinyloidut koetin-DNA-hybridit eristettiin ja puhdistettiin streptovidiinilla konjugoiduilla magneettisilla hiukkasilla; tuloksena olevan DNA-kirjaston toinen monistus ja laadullinen arviointi suoritettiin (TapeStation 4200; Agilent Technologies). Kohteen ulkopuolisten monistusfragmenttien ja adapteridimeerien poistamiseksi DNA-kirjasto puhdistettiin uudelleen käyttämällä AMPureXP Beads -magneettisia hiukkasia (kuva 1). Valmistetun kirjaston lopullinen konsentraatio arvioitiin Quantus-instrumentilla käyttämällä kaupallista QuantiFluor® dsDNA System -sarjaa (Promega). Tuloksena saatu DNA-kirjasto immobilisoitiin virtaussolun pinnalle. Sekvensointi suoritettiin Illumina-alustalla käyttämällä Standard Flow Cell- ja MiSeq Reagent Kit v2 300 -tuotteita (2 x 150 sykliä). Saatu DNA-kirjasto immobilisoitiin virtaussolun pinnalle. Sekvensointi suoritettiin Illumina-alustalla käyttämällä Standard Flow Cell- ja MiSeq Reagent Kit v2 300 -laitteita (2 x 150 sykliä). Saatu DNA-kirjasto immobilisoitiin virtaussolun pinnalle. Sekvensointi suoritettiin Illumina-alustalla käyttämällä Standard Flow Cell- ja MiSeq Reagent Kit v2 300 -laitteita (2 x 150 sykliä).
Kuvio: 1
Sekvensoidun DNA: n laadun yleinen arviointi
Alkuperäisessä laadun arvioinnissa käytettiin standardimenetelmiä, kuten FastQC ja Jellyfish ja KraTER-ohjelmia. Laadunarviointi ei osoittanut, että molemmille näytteille sekvensoitujen DNA-lukujen laatuongelmia olisi. Kuvia ei näytetä, koska ne eivät ole informatiivisia.
Ensimmäiselle näytteelle (edelleen M, iso muumio "Maria") sekvensoitiin 113,4M lukemat, toiselle näytteelle (edelleen W, pieni muumio "WaWita") sekvensoitiin 22,9M lukemat.
Seuraava vaihe oli puhdistaa sekvensoidut lukemat useista teknisistä sekvensseistä, jotka häiritsisivät lisäanalyysejä. Tätä varten käytettiin Cookiecutter-ohjelmaa. Puhdistuksen jälkeen oli M3: n ja W: n lukumäärä 113,3 M (99%) ja 22,8 M (99%).
Arvio muinaisen DNA: n määrästä ja sen erottamisesta nykyaikaisesta
Tavanomainen menetelmä antiikin DNA: n läsnäolon ja määrän arvioimiseksi on estää aikavaurioituneiden nukleotidien määrä. Tätä varten käytettiin MapDamage 2.0 -ohjelmaa. MapDamage 2.0, joka osoitti muinaisen DNA: n määrän 30,1%, mutta koska MapDamage viittaa siihen, että käytämme läheistä referenssiä, emmekä tiedä tarkalleen, kuinka lähellä molemmat näytteet ovat nykyaikaisten ihmisten genomiin, ja käytimme exome-kirjastoa, tämä menetelmä itsessään ei ollut riittävästi. Toinen hyvä menetelmä muinaisen DNA: n arvioimiseksi on lyhyiden fragmenttien lukumäärä.
Väitetyn antiikin DNA: n suodatus tapahtui kolmessa vaiheessa. Ensimmäisessä vaiheessa kaikki parilliset lukemat, joita ei voida ylittää ja koota yhteen pariksi lukemaksi, jossa on päällekkäisyys, poistettiin. Nämä lukemat osoittivat, että alkuperäinen sekvensoitu fragmentti oli pidempi kuin 300 bp. ja todennäköisesti moderni DNA. Joten tämän vaiheen jälkeen 86,9% ja 91,8% pysyivät vastaavasti. Sen jälkeen valittiin yksittäiset päällekkäiset fragmentit siten, että niiden pituus oli alle 150 bp, koska tämän odotimme antiikin DNA: lta. Tämän vaiheen jälkeen näytteille M ja W pysyi vastaavasti 8,6% ja 38,5%. Olisi huomattava, että huolimatta prosenttierot, näytteiden M ja W absoluuttinen lukumäärä on hyvin samanlainen: 9,8M ja 8,8M, mikä selitetään sillä, että muinaisen DNA: n pitoisuus molemmissa näytteissä on samanlainen.
| Parametri | Näyte M (Maria) | Näyte W (Wawita) |
| Lukemien lukumäärä | 113.3M | 22.8M |
| Prosenttiosuus lyhyistä katkelmista <300 bp | 86,9% | 91,8% |
|
Prosenttiosuus lyhyistä katkelmista <150 bp (lukumäärä) |
8,6% (9,846,035) |
38,5% (8 813 220) |
|
Prosenttiosuus fragmenteista, jotka on kohdistettu ihmisen genomiin (lukumäärä) |
2,03% (2 345 084) |
9,65% (2 264 551) |
| Prosenttiosuus fragmenteista, jotka ovat linjassa ihmisen perimää kohti, lyhyestä <150 bp | 23,8% | 25,6% |
DNA: n saaminen samanlaiseksi kuin ihmisen vertailugenomi
Tuloksena oleva oletettu muinainen DNA kartoitettiin ihmisen vertailugenomiin käyttämällä standardi genomivarianttihakuputkea käyttämällä BWA: ta, samtooleja ja Wcftooleja.
Lisäksi vain 23,8% näytteestä M ja 25,6% kartoitettiin onnistuneesti nyky-ihmisten vertail genomiin. Samanaikaisesti molemmille näytteille 75% sekvensoiduista lukemista ei voitu kartoittaa ihmisen genomiin. Tämä selitetään sekä kontaminaatiolla että sillä, että nämä näytteet sijaitsevat riittävän kaukana nykyisten ihmisten genomista. Samalla on syytä pitää mielessä, että olemme sekvensoineet eksomikirjaston ja minimoineet siten bakteeri-DNA: n saastumisen.
Keittämättömien lukujen alustava tiedusteluanalyysi osoitti, että jotkut niistä kuuluivat toistuvaan DNA: han, joka oli spesifinen sorkka- ja kavioeläimille, tämä voidaan selittää sillä, että laamarasvaa käytettiin muumioitumiseen.
Yksityiskohtaisempaan analyysiin kestää noin kolme viikkoa laskelmia, koska olemassa olevat ratkaisut tehtiin vain virus- ja bakteerigenogeille, ja meidän on verrattava kaikkiin olemassa oleviin genomiin, mukaan lukien kasvien perimät, ymmärtääksemme, mitkä lajit sekvensoitiin.
Löydettyjen vaihtoehtojen ominaisuudet
Kartoitettuja lukemia käytettiin etsimään variantteja, jotka erottavat M- ja W-näytteet modernin ihmisen genomista, sekä arvioimaan ihmisen Y-kromosomin lukemien kontaminaatiota.
Ensimmäinen kysymys, johon tarvittiin vastaus, oli mihin kromosomeihin sekvensoidut lukemat kartoitettiin.
Koska tiedämme, että Marian näytteet oli eristetty luista ja lihaksista ja Vavita vain luista, odotimme eroa mtDNA: n määrässä. Mutta eroa ei ollut paljon.
Y: n kanssa kartoitettujen lukumäärien lukumäärä on toinen testi nykyaikaisten ihmisten aiheuttamalle kontaminaatiolle. Mielenkiintoista se, että se osoittautui samanlaiseksi molemmissa näytteissä.
Löydättyjen varianttien tilastotiedot on esitetty alla:
| parametrit | Näyte M (Maria) | Näyte W (Wawita) |
| Löydettyjen vaihtoehtojen määrä | 79957 | 48941 |
| Vaihtoehtojen määrä Y: llä | 534 | 541 |
| Luotettavien vaihtoehtojen lukumäärä (yli 20 lukemaa ja yli 30 laatua) | 16969 | 6181 |
| Variantit tunnetulla rsidillä (saatavana snip-tietokannassa) | 5701 | 3089 |
| Yleiset voimassa olevat vaihtoehdot | 92 | |
| yleisiä vaihtoehtoja rsid-sovelluksen kanssa | 49 |
Sen jälkeen tuli mahdolliseksi vastata kysymykseen: ovatko M- ja W-sukulaiset? Vastaus on ei.
Vain 49 vastaavaa varianttia löytyi M: n ja W: n välillä ja 3040: stä, jotka eroavat muunnettujen rsid-varianttien kanssa. Lisäksi ehkä nämä ovat ihmisen tai tuntemattoman olennon erityyppejä tai alalajeja.
Mielenkiintoista on, että variantit Y-kromosomilla ovat identtisiä molemmille näytteille, mikä osoittaa saastumisen saman henkilön toimesta, ja että Y-kromosomin muinaisessa DNA: ssa ei todennäköisesti vielä ole kromosomia.
Arviointi samanlaisuudesta olemassa olevien sekvensoitujen ihmisen genomien kanssa 1000 ihmisen genomihankkeesta
Huomaa, että tämä on vain likimääräinen analyysi, koska tarkempaan analyysiin tarvitaan variantteja genomin alueilta neutraalissa valinnassa, ja meillä on exome-tietoja.
Siitä huolimatta, että käytettiin 5708 varianttia M: lle tai 3096 S: lle, oli mahdollista suorittaa variantti analyysistä verrattuna 1000 ihmisen genomin tietoihin.
Oheisen kuvan PCA-analyysin tulos on kahden kuvan M ja W erikseen laskettu summa, koska M: n ja W: n välillä on liian vähän yhteisiä vaihtoehtoja M: n ja W: n välisten etäisyyksien arvioimiseksi.
Samankaltaisuuspiste.
Kuten huomaat, mikään geeniryhmä ei ole sattuma, ne eroavat toisistaan. Mutta on pidettävä mielessä, että käytimme koodaussekvenssejä valinnan alla, ja on suositeltavaa käyttää variantteja neutraalissa valinnassa.
Siitä huolimatta PCA-tulos on hyvin sopusoinnussa varianttien manuaalisen todentamisen kanssa, mikä osoitti, että tiedot ovat viittaamattomassa homotsygootissa, mikä taas osoittaa, että kuvat ovat kaukana modernin ihmisen genomista.
johtopäätös
Valitettavasti rajoitimme vain kahteen näytteeseen, yleensä tämän tyyppisissä analyyseissä käytetään enemmän, ainakin 3-10 ainakin jotenkin sukulaisia. Siksi on tarpeen jatkaa tutkimusta suurella määrällä näytteitä.
Samaan aikaan voimme todennäköisesti päätellä, että Marian ja Vavitan DNA-näytteet vastaavat ihmisen DNA: ta, mutta eivät ole samat DNA: n kanssa, joka meille on saatavana 1000 ihmisen tietokannasta.
Raportin kirjoittajat: Baranov V. S. ja Aseev M. V. (Synnytys- ja gynekologian tieteellinen tutkimuslaitos, vastasyntyneiden diagnostiikan osasto), Glotov A. S. ja Glotov O. S. (Pietarin osavaltion yliopisto), A. Komissarov (Sytologian instituutti, Venäjän tiedeakatemia, Geneettisen bioinformatiikan keskus).
Materiaalit ovat toimittaneet Konstantin Georgievich Korotkov (teknillisten tieteiden tohtori, professori, tietotekniikan yliopisto, mekaniikka ja optiikka) ja Dmitry Vladislavovich Galetsky (lääketieteen kandidaatti, I. P. Pavlovin ensimmäinen Pietarin osavaltion lääketieteellinen yliopisto).
Lisätietoja Nazca-muumioista on merkinnässä: Nazca-muumioita.
