Tutkijat toivovat suuresti CRISPR / Cas9-tekniikkaa, joka mahdollistaa tarkat muutokset elävien organismien, myös ihmisten, genomeissa. Kaikki uudet tieteelliset artikkelit julkaistaan, joissa kuvataan erityyppisiä CRISPR-järjestelmiä ja niiden muutoksia. "Lenta.ru" kertoo tämän alueen löytöistä, jotka tehtiin vuonna 2016.
Tuhannet heistä
CRISPR / Cas9 on bakteerien adaptiivinen immuniteettijärjestelmä, joka antaa mikro-organismien taistella viruksia vastaan. Se koostuu välikappaleista - DNA-osista, jotka vastaavat tarttuvan aineen DNA: n tiettyjä fragmentteja (protospacereita). Välilevyt koodaavat spesifisiä crRNA-molekyylejä, jotka sitoutuvat Cas9-entsyymiin. Tuloksena oleva kompleksi kiinnittyy viruksen DNA-ketjuun, ja Cas9 toimii saksena ja leikkaa sen.
Itse asiassa CRISPR / Cas9 on vain yksi monista samanlaisista järjestelmistä, joita bakteereilla ja arkeilla on. Tutkijat jakavat ne kahteen luokkaan. Ensimmäiseen luokkaan kuuluvat tyypin I, III ja IV CRISPR-järjestelmät ja toinen - II ja V. Tyyppi II sisältää Cas9-proteiinin, joka on mukana uusien välikappaleiden hankinnassa, crRNA: n kertymisessä solussa ja DNA: n pilkkomisessa. Muissa järjestelmissä moniproteiinikomplekseja käytetään näihin tarkoituksiin. Tämä tekee tyypistä II yksinkertaisimman tyypin CRISPR-järjestelmän, joka soveltuu geenitekniikan tarpeisiin.
Tyypit voidaan puolestaan jakaa alatyyppeihin riippuen siitä, mitkä muut geenit liittyvät CRISPR: ään. Siten IIA-järjestelmät sisältävät csn2-geenin, joka koodaa DNA: han sitoutuvaa proteiinia ja osallistuu välikeiden hankkimiseen. IIB-järjestelmissä csn2 puuttuu, mutta on olemassa cas4-geeni, jonka toimintaa ei vielä tunneta, ja IIC-järjestelmissä ei ole csn2: ta eikä cas4: ää.
Aarteet bakteerien sisällä
Mainosvideo:
Tutkijat ovat löytäneet kaikki tunnetut CRISPR-järjestelmät laboratorio-olosuhteissa kasvatetuista bakteereista. Viljelemättömiä mikro-organismeja on kuitenkin valtava määrä, joihin kuuluu sekä arkeoita että bakteereja. He elävät yleensä ääriolosuhteissa - mineraalilähteissä tai myrkyllisissä vesistöissä hylätyissä kaivoksissa. Tutkijat voivat kuitenkin eristää DNA: n niistä ja tunnistaa tietyt alueet siinä. Luonnossa 22. joulukuuta julkaistussa uudessa paperissa Berkeleyn Kalifornian yliopiston geneettiset asiantuntijat dekoodaivat luonnollisten mikrobiyhteisöjen genomit ja löysivät muita CRISPR-järjestelmän muunnelmia.
Bakteriofagi - virus, joka tartuttaa bakteereja
Kuva: Giovanni Cancemi / Depositphotos
Tutkijat onnistuivat selvittämään, että joillakin vähän tutkituilla arkkimaisilla nanorganismeilla ARMAN on myös CRISPR / Cas9, vaikka aiemmin ajateltiin, että vain bakteereilla on niitä. On huomattava, että tällä järjestelmällä on väliasema alatyyppien IIC ja IIB välillä ja se voi toimia puolustuksena loisia "hyppyjä" geenejä (transposoneja) vastaan, jotka tulevat mikro-organismiin muista arkeista. Yritys jäljentää arkeologisen CRISPR / Cas9: n aktiivisuutta E. colissa (Escherichia coli) ei johtanut mihinkään, mikä viittaa joidenkin järjestelmää säätelevien erityismekanismien olemassaoloon.
Uusia toisen luokan järjestelmiä, CRISPR / CasX ja CRISPR / CasY, tunnistettiin myös pohjavesissä ja sedimenteissä elävistä bakteereista. CRISPR / CasX-järjestelmä sisältää proteiineja Cas1, Cas2, Cas4 ja CasX. Jälkimmäinen, kuten E. colilla tehdyissä kokeissa on osoitettu, erottuu nukleaasiaktiivisuudesta, toisin sanoen se kykenee pilkkomaan vieraan DNA: n, kuten Cas9. Tämä tapahtuu kuitenkin vain, jos TTCN-sekvenssi on protospacersin edessä, jossa N on mikä tahansa neljästä nukleotidista. Tällaisia sekvenssejä kutsutaan PAM: ksi (protospacerin viereinen motiivi - motiivi, joka on vieressä protospaceriin). CRISPR / Cas9-järjestelmällä on myös oma PAM - NGG, jonka tulisi sijaita protospacerin jälkeen. Lisäksi CRISPR / CasY pystyy leikkaamaan DNA: ta, jos kohdekohdan lähellä on TA PAM-sekvenssi.
Mikä on tämän löydön lupaus? Tosiasia on, että havaitut järjestelmät ovat tällä hetkellä tunnetuimpia. Tutkijoiden mukaan heidän työhönsä tarvittava pieni määrä proteiineja tekee CRISPR / CasX- ja CRISPR / CasY-laitteista käteviä työkaluja DNA: n muokkaamiseen. Lisäksi metagenomiset tutkimukset, joissa tutkitaan ympäristöstä saatua DNA: ta, paljastavat muun tyyppisiä CRISPR-järjestelmiä, jotka ovat hyödyllisiä geenitekniikassa.
Polku huippuosaamiseen
Tietenkin on olemassa vaihtoehto CRISPR-järjestelmien etsimiselle luonnossa - jo olemassa olevan CRISPR / Cas9-tekniikan parantaminen. Suuresta tarkkuudestaan huolimatta hän tekee virheitä leikkaamalla DNA väärään paikkaan. Tämä vaikeuttaa oikeiden muutosten tekemistä geeneissä ja hoitaa siten perinnöllisiä sairauksia tehokkaasti. Siksi tutkijat etsivät tapoja parantaa järjestelmän suorituskykyä. Vuonna 2016 CRISPR: n muokkaamiseen ja sen muuttamiseen erilaisiksi geenityökaluiksi on omistettu monia tieteellisiä julkaisuja.
Proteiini Cas9 ja crRNA - CRISPR-järjestelmän pääkomponentit
Kuva: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT
Joten Cell-lehti julkaisi 8. joulukuuta artikkelin Toronton yliopiston tutkijoilta, jotka ovat luoneet "anti-CRISPR" -järjestelmän, joka sammuttaa mekanismin tietyissä olosuhteissa. Tämä mahdollistaa Cas9-aktiivisuuden tukahduttamisen, jos ohjaava RNA sitoutuu väärään fragmenttiin ja estää virheet. Anti-CRISPR koostuu kolmesta nukleaasia estävästä proteiinista. Luonnollisesti alun perin sitä eivät keksineet tutkijat, vaan virukset, jotka neutraloivat siten bakteerien immuniteetin.
Kesäkuussa amerikkalaiset tutkijat vahvistivat yhdessä venäläisten kollegoiden kanssa, että CRUSPR / C2c2-järjestelmä, joka on saatu fusobacterium Leptotrichia shahii: sta, pystyy pilkkomaan yksijuosteisen RNA: n. Tämän seurauksena CRISPR-järjestelmää voidaan käyttää Messenger RNA: n tyhjentämiseen - toimintojen tukahduttamiseen -, joka kuljettaa tietoa geeneistä ribosomeihin, joissa proteiinit syntetisoidaan sen perusteella.
Kalifornian yliopiston tutkijat loivat toukokuussa CRISPR-EZ-tekniikan, joka mahdollistaa uusien DNA-molekyylien lisäämisen hiiren alkioiden genomeihin melkein 100% menestyksellä. CRISPR / Cas9-järjestelmä viedään hedelmöityneisiin eläinmuniin mikroskooppisella neulalla ja pienellä sähköpurkauksella. Kokeessaan tutkijat onnistuivat tuomaan mutaation geenissä 88 prosentissa hiiristä. Tämä ylittää geneettisesti muunnettujen hiirten lukumäärän, jotka on tuotettu CRISPR-muokkauksella, joka käyttää tavanomaisia injektioita.
Huhtikuussa Massachusettsin yliopiston lääketieteellisen korkeakoulun molekyylibiologit käyttivät Cas9: n mutanttimuunnosta, josta puuttuu nukleaasiaktiivisuus, ja kehittivät CRISPRainbow-tekniikan. Ohjaava RNA, joka osoittaa, missä entsyymit kiinnittyvät, sisälsi fluoresoivia leimoja, mikä mahdollistaa esimerkiksi liikkuvien geneettisten elementtien liikkeen seuraamisen.
Anopheles-hyttys voi olla CRISPR-järjestelmien ensimmäinen uhri
Kuva: Jim Gathany / Wikipedia
Uusi uljas maailma
Tutkijat käyttävät jo CRISPR-järjestelmiä geneettisesti muunnettujen organismien, kuten malariahyttysen, luomiseen, jotka levittävät haitallisia geenejä villien sukulaistensa keskuudessa. Tätä menetelmää kutsutaan geenivoimaksi. Jos yksi yksilön vanhemmista oli mutanttigeenin kantaja, hän välittää sen jälkeläisilleen 50 prosentin todennäköisyydellä. Tämä johtuu siitä, että vanhemmalla on kaksi kopiota geenistä, ja vain yksi niistä on viallinen. CRISPR pystyy kopioimaan mutanttifragmentin ja lisäämään sen terveeseen geeniin. Tämän seurauksena jälkeläiset saavat mutaation 100% todennäköisyydellä.
Vuonna 2016 rekombinantti-DNA: n neuvoa-antavan komitean (RAC) asiantuntijat hyväksyivät Pennsylvanian yliopiston hakemuksen suorittaa ihmisen geneettisen muuntamisen testit CRISPR / Cas9-tekniikan avulla.
Kiinalaiset kuitenkin ohittivat heidät. Marraskuussa Nature-lehti kertoi, että kiinalaiset tutkijat toivat ensimmäistä kertaa ihmisiin soluja CRISPR / Cas9-järjestelmän modifioimilla geeneillä. Tutkijat poimivat immuunisolut (T-lymfosyytit) metastaattista keuhkosyöpää sairastavan potilaan verestä ja käyttivät sitten CRISPR-tekniikkaa sammuttaakseen PD-1-proteiinia koodaavan geenin. Jälkimmäisen on osoitettu tukahduttavan immuniteetin edistämällä kasvaimen kasvua. Tutkijat viljelivät muokattuja soluja lisäämällä niiden lukumäärää ja ruiskuttamalla ne sitten takaisin ihmiskehoon. Geeniterapian selviytyminen taudista on vielä nähtävissä.
CRISPR-järjestelmiä voidaan käyttää myös HIV: n ja ihmisten perinnöllisten sairauksien torjunnassa. Tehokkaiden hoitojen kehittämiseksi tarvitaan kuitenkin lisätutkimuksia. Emme tietenkään puhu mutanteista, kuten tieteiselokuvissa, mutta tutkijat pystyvät nopeasti luomaan geneettisesti muunnettuja organismeja, kuten viljelykasveja, jotka ovat vastustuskykyisiä loisille. Vielä on nähtävissä, miksi tutkijat, jotka löysivät CRISPR: n ja keksivät miten sitä voitaisiin käyttää, eivät ole vielä voittaneet Nobelin palkintoa.
Alexander Enikeev